中華人民共和國衛生行業標準
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目次
前言
1． 范圍
2． 引用標準
3． 定義
4． 進行厭氧菌敏感試驗的指征
5． 厭氧菌敏感試驗的局限性
6． 抗微生物藥
7． 常規試驗和報告中抗微生物藥的選擇
8． 稀釋試驗接種物制備
9． 參考瓊脂稀釋法（Wadsworth法）
10. 微量肉湯稀釋法
11.β-內酰胺酶試驗
12. 質量控制的方法
附錄：培養基和補充劑的制備
表1：厭氧菌試驗應考慮的抗微生物藥推薦分組
表2：解釋標準和相對應最低抑菌濃度（MIC）值
表3：制備抗微生物藥貯存液需要的溶劑和稀釋液
表4：瓊脂稀釋法或微量肉湯稀釋法敏感試驗中抗微生物藥稀釋液的制備方案
表5：參比瓊脂稀釋試驗標質控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質控允許范圍
表6：微量肉湯稀釋試驗質控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質控允許范圍
前言
臨床細菌分離中由于厭氧菌感染日漸增多，厭氧菌的藥敏試驗和耐藥監測已提到日程上。本標準是在衛生部頒發的《全國臨床檢驗操作規程》（第三版）的基礎上，依據美國國家臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS）M11-A5文件－厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗方法（已批準的標準－第五版）[ISBN 1-56238-429-5]，結合中國國情及衛生系統的實際情況和要求制定。
本標準從2004年 月 日起實施。
本標準由衛生部提出。
本標準起草單位：北京大學人民醫院檢驗科。
本標準主要起草人：張正 岳志紅。
本標準由衛生部委托衛生部臨床檢驗中心負責解釋。
中華人民共和國衛生行業標準
WS/T×××-200×
厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗方法
Methods for Antimicrobial Susceptibility
Testing of Anaerobic Bacteria
1. 范圍
本文件所述方法主要用于測試普通分離到的厭氧菌。瓊脂稀釋法可用于測試大多數厭氧病原菌。目前微量肉湯稀釋法僅用于測試脆弱擬桿菌菌群的病原菌。本標準適用于從事厭氧菌抗微生物藥敏感試驗的臨床實驗室使用。
2. 引用標準
下列標準條文主要根據美國NCCLS的M11-A5文件和中華人民共和國衛生部醫政司編制的《全國臨床檢驗操作規程》（第三版）而制定。
3. 定義
3.1瓊脂稀釋敏感試驗
將某一種抗微生物藥的系列濃度混入用于敏感試驗的瓊脂生長培養基進行的抗微生物藥敏感試驗。
3.2敏感
指該菌株所致感染可以用推薦用于此型感染及病原菌的抗微生物藥劑量進行恰當地治療。
3.3中介
藥物在生理濃集的部位具有臨床效力或者可用高于正常劑量的藥物進行治療；此還包括一個“緩沖區”可以防止微小的，未能控制的技術因素造成重大的結果解釋錯誤。
3.4 耐藥
指常規劑量抗微生物藥通常達到的濃度不能抑制該菌株的生長和/或該菌株的MIC落于某范圍內。在此范圍內，可存在某些特定的耐藥機制（如β-內酰胺酶類），并且治療研究顯示其臨床療效并不可靠。
3.5最小抑菌濃度
瓊脂或肉湯稀釋敏感試驗中抗微生物藥抑制某一種微生物可見生長的最低濃度。
4. 進行厭氧菌敏感試驗的指征
臨床上有厭氧菌感染存在，并在實驗室分離出厭氧菌，原則上均應進行抗微生物藥敏感試驗。
4.1 常規試驗
從腦膿腫、心內膜炎、骨髓炎、關節感染、人工裝置或人工血管感染和菌血癥分離到的特殊感染的標本應該測試，并應參考臨床醫生的合理建議。
當感染的性質不清楚，標本含有內源性厭氧菌菌群，而且病原菌與正在治療的感染關系很少時，通常不必做敏感試驗。當存在多種厭氧菌時，參考臨床情況選擇可能引起厭氧菌感染的最重要菌種進行敏感試驗。一般分離到擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬。梭菌屬、嗜膽菌屬和薩頓氏菌屬的一些菌種應做敏感試驗。
敏感試驗應使用分純后菌懸液。不能直接用臨床標本進行敏感試驗。MIC試驗一般采用倍比稀釋，采用本標準推薦方法，做好質控，結果報告采用在實際終點時的一個倍比稀釋范圍內較為科學。例如：終點為16μg/mL，真正報告應8μg/ml-32μg/ml范圍更好。并做出敏感、中介或耐藥判斷，以供臨床參考。
4.2 監測試驗
當技術條件不允許每個實驗室都進行厭氧菌敏感試驗時，建議當地建立參考實驗室，收集一定量臨床菌株（不少于50-100株），集中測試后公布結果供大家參考。
5. 厭氧菌敏感試驗的局限性
體外結果不足以預測某個病人對厭氧菌感染治療的反應，僅供臨床選藥參考。此標準的試驗方法也并不一定適用于所有的厭氧菌，以下2點需考慮。
5.1 折點和臨床相關
關于確定厭氧菌對大多數抗微生物藥的敏感性的折點，現在并無一致意見。目前折點的確定是基于動物模型或需氧和厭氧菌多重感染的病人的臨床試驗結果。因為大多數厭氧菌感染發生于密閉空間，涉及多種微生物，單一抗微生物藥抗單一微生物的體外活性并不直接與其體內效力相關。
除數目分布和臨床效力之外，MIC結果的敏感和中介折點解釋是基于最大的推薦劑量獲得的血清水平，因為厭氧菌感染通常推薦最大劑量用藥。建立中介范圍是因為有些藥物難于判讀終點和MIC在折點附近聚集。
5.2 病原菌
瓊脂稀釋法適用于測試多種不同的厭氧菌。至今為止，微量肉湯稀釋法僅限于測試脆弱擬桿菌菌群。當測試菌呈蔓延生長時（例如艱難梭菌或破傷風梭菌），則需要盡量在瓊脂平板上劃開接種物。而對于敗毒梭菌，每個平板只能測試一個分離株。
6. 抗微生物藥
6.1 來源
抗微生物藥標準品或參考藥品可直接來自廠商，或來自中國藥品及食品監督管理局檢定所，或其他商業途徑。不應把非腸道的制品用于敏感試驗。可接受的藥品應貼有標簽，標明藥品的通用名，批號，分析活力（常用每mg藥品中含μg或國際單位（IU）表示）和有效期。貯存于規定的溫度和濕度中。用時防止冷凝水進入。
6.2 抗微生物藥的稱量
實驗室必須根據該批待用藥品的分析結果來標化其抗微生物藥溶液。抗微生物藥品應使用經計量認證的分析天平稱量。公式如下：
重量(mg)=體積（mL）×所需濃度（μg/mL）
分析活力（μg/mg）
或
體積（mL）=重量(mg)×分析活力（μg/mg）
所需濃度（μg/mL）
6.3 制備貯存液
抗微生物藥貯存液制備的濃度一般應該至少為1,000μg/mL(如1,280μg/mL)或者是最高測試濃度的10倍。某些藥物必須溶解于非水溶劑中。此時，應使用盡量少的溶劑來溶解抗微生物藥。最終的貯存液可用水或表3所述的合適的稀釋劑進行稀釋。貯存液分裝后貯存于規定溫度下，一般-60℃可保存半年。
6.4 測試濃度的數目
一種特定抗微生物藥的測試濃度應包含表2所示的解釋性折點，但實測的濃度數目是由實驗室決定的。MIC結果報告推薦選用五個或更多濃度。建議選用的范圍應包涵質控菌株的在控數值。
7. 常規試驗和報告中抗微生物藥的選擇
敏感試驗抗微生物藥品種類選擇可參考表1。在實際應用中，應結合我國實情，參考實驗室所在的臨床單位醫生及控感科意見做出合適選擇，不斷積累經驗。
完整的報告單應包括患者一般資料（姓名、性別、年齡和病理號等）。藥品名稱應按照我國藥典頒布名稱。菌種名稱按照衛生部已公布名詞標準。應報告敏感、中介和耐藥。
8. 稀釋試驗接種物制備
受試菌應是從強化布氏血瓊脂選擇經充足時間孵育（24-48小時）產生的合適大小的菌落。菌落直徑通常至少1毫米。快速生長菌如脆弱擬桿菌菌群和產氣莢膜梭菌可經24小時孵育后測試，而其它大多數厭氧菌需要48小時孵育。對于緩慢生長的厭氧菌，如嗜膽菌屬和纖細彎曲桿菌，可以從多個瓊脂平板制備接種物以保證標準化的準確。可通過生長法或直接菌落懸液法制備接種物。
8.1 制備接種物時的濁度標準
為使敏感試驗的接種濃度標準化，應使用一個等同于0.5號麥氏（McFarland）標準管的BaSO4濁度標準管或其光學等同物（如乳膠顆粒懸液）。BaSO4的0.5號麥氏標準管制備見附錄。
8.2分離株的貯存和復蘇
8.2.1 冷凍
大多數厭氧菌可在20％甘油中在-60℃或更低溫度保存數年。將四份48小時肉湯培養物轉移到含有一份無菌甘油的無菌玻璃瓶中。充分混勻成均一懸液后冷凍。預還原時使用不加糖的皰肉培養基。
另外，也可將48小時平板培養的若干菌落直接懸浮于20％滅菌脫脂牛奶中，-60℃冷凍。
8.2.2 復蘇
凍存的分離株必須在強化布氏血瓊脂上至少傳代兩次，用于敏感試驗前必須證明其純度。
8.3 生長法
（1） 從強化布氏血瓊脂選擇經24小時或充足時間孵育產生的合適大小的菌落（直徑至少1毫米）。挑取形態特征完全一致的至少5個菌落，或用3mm直徑的接種環取滿一環，接種于無指示劑的硫代硫酸鹽培養基。如果此步驟使用厭氧箱，可使用強化布氏肉湯，強化腦心浸液或Schaedler氏肉湯替代硫代硫酸鹽肉湯。
（2） 孵育肉湯6-24小時或直至獲得足夠濁度。
（3） 加入布氏肉湯或其它使用前預還原或煮沸后冷卻的肉湯，調整濁度等于0.5號麥氏標準。對于大腸桿菌ATCC25922或脆弱擬桿菌ATCC25285，此時懸液中細菌數約為1-2×108CFU/mL。但應注意到不同厭氧菌分離株接種大小的變化。
8.4 直接菌落懸液法
（1） 此法是從孵育了24-48小時強化布氏血瓊脂平板挑取菌落。制備懸液時平板在有氧環境中不應超過30分鐘。
（2） 輕輕挑取形態特征完全一致的至少5個菌落，直接轉移到布氏肉湯或其它使用前預還原或煮沸后冷卻的肉湯，獲得相當于0.5麥氏標準的濁度。
（3） 此法制備厭氧菌的一些菌種菌懸液計數會輕度升高。
9. 參考瓊脂稀釋法（Wadsworth法）
9.1 試劑和材料
9.1.1 厭氧罐（箱）
采用環境含4-7％CO2厭氧罐（箱），并應有無氧狀態指示劑。
9.1.2 強化布氏瓊脂
使用的培養基是每mL布氏瓊脂中添加5μg氯化血紅素、1μg維生素K1和5％脫纖維羊血(v/v)。布氏瓊脂的組成和制備，補充劑的制備和添加詳見附錄。也可提前配制瓊脂，使用當天融化。制備抗微生物藥稀釋液后，抗微生物藥和脫纖維羊血一起加入到融化瓊脂中。
9.2 瓊脂稀釋平板的制備步驟
開始前，確定抗微生物藥及其所用濃度。制備瓊脂稀釋平板時，15×100圓形平板需要20mL瓊脂，方形平板需要30mL。平板的制備是將一份10×抗微生物藥溶液加入到九份瓊脂中。例如：制備20mL瓊脂的圓形平板，需要在17mL已添加氯化血紅素和維生素K1的融化的布氏瓊脂（保持在45℃-50℃）中加入1mL脫纖維羊血和2mL10×抗微生物藥溶液。方形平板則是25.5mL布氏瓊脂、1.5mL脫纖維羊血和3mL10×抗微生物藥溶液。
9.2.1 制備瓊脂空白
（1） 試驗前或試驗中，準備足夠已添加維生素K1和氯化血紅素的布氏瓊脂，分配合適的量到試管中。每種抗微生物藥的每個濃度準備一管。
（2） 如果試驗當天使用，分配后置于48℃-50℃水浴。如果提前制備，融化培養基（沸騰水浴，微波爐或高壓鍋），置于水浴（48℃-50℃）中冷卻。
9.2.2 制備抗微生物藥稀釋液
（1） 融化以前制備的抗微生物藥貯存液，或試驗當天制備。
（2） 將設計好數量（見表4）的滅菌蒸餾水加入相應管中，制備稀釋液空白。
（3） 使用表4所述稀釋規則， 1:2，1:4，和1:8連續稀釋制備中間濃度（10×）抗微生物藥溶液，而不是直接倍比稀釋。此方法制備稀釋液可使稀釋錯誤最小化。
9.2.3 制備瓊脂稀釋平板
（1） 標記制備的每一種抗微生物藥的每一種濃度的平板，將平板置于水平臺面上。
（2） 對于制備的每一種抗微生物藥濃度，將1mL脫纖維羊血（對于方形平板1.5mL）和2mL10×抗微生物藥溶液（對于方形平板3mL）加入到17mL融化并冷卻的強化布氏瓊脂（對于方形平板25.5mL）試管中。蓋緊試管蓋子，輕輕翻轉數次混勻，小心不要產生氣泡。倒入平板，固化。
（3） 如果測試一種抗微生物藥，應準備另外四個不加抗微生物藥的平板，和以上（2）相同的步驟，但用滅菌蒸餾水替代抗微生物藥溶液。對于另外測試的每一種抗微生物藥，準備另外一個不加抗微生物藥的平板。
（4） 瓊脂固化后，可將平板蓋子半開置于層流罩或溫箱約30分鐘使其干燥。或者是翻轉平板將瓊脂底蓋支在蓋子上。
9.2.4 瓊脂稀釋平板的貯存
（1） 用于常規試驗，試驗前密封于塑料袋中于2℃-8℃貯存，不超過7天。
（2） 用于研究和評估目的，推薦貯存期不超過72小時。
（3） 含亞胺培南，克拉維酸或其它已知不穩定的β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑組合的抗微生物藥的平板必須在試驗當天配制。
9.3 接種瓊脂稀釋平板
接種物接種到瓊脂表面的最簡便的方法是使用多點接種器取1-2μL接種到瓊脂表面。那么最終瓊脂上接種物每點接近105CFU。由于大多數厭氧菌能暫時容忍暴露于氧氣，所有操作可在外界環境中進行。一些苛養菌分離株則必需使用預還原平板和在厭氧環境中進行所有操作。
（1） 使微生物生長到濁度等于0.5號麥氏標準或將菌落直接制成懸液到相同濁度，制備標準化的接種物。
（2） 試管按順序排列在架子上，將少量體積（約0.5mL）移至多點接種器的相應孔中。在瓊脂平板上做標記，以標明接種點的方位。
（3） 小心避免飛濺。
（4） 順序：從最低到最高的藥物濃度依次接種。
（5） 質控：試驗開始時首先接種兩個無抗微生物藥的對照平板。其中一個平板標記“pre-O2”（檢查需氧菌污染），另外一個平板標記“pre-Ana”（厭氧菌最初生長對照）。每一系列平板之間，接種一個無抗微生物藥的對照平板做生長對照。最后，再次接種兩個平板，標記為“post-O2”和“post-Ana”，來證實最終病原菌生長力和純度。
9.4 孵育瓊脂稀釋平板
（1） 平板一旦變干，翻轉后置于厭氧罐或替代厭氧環境中35℃孵育42-48小時。
（2） 有氧孵育平板（證實有氧環境中未能生長）應置于含有5％CO2環境中35℃孵育42-48小時。
9.5 判讀瓊脂稀釋終點
（1） 在黑色不反光的背景下觀察每一平板。首先判讀對照平板，尋找需氧菌可能污染或孔間交叉污染。如果檢測到污染，則必需重新測試。
（2） 判讀MIC終點是和厭氧菌對照平板相比生長特征發生顯著抑制的測試平板的濃度。樣本的一個顯著生長變化包括薄霧狀、多個細小菌落，或一個到數個正常大小菌落。
10. 微量肉湯稀釋法
此法僅適用于測試脆弱擬桿菌菌群。
10.1 試劑和材料
10.1.1 厭氧罐（箱）
附錄所述瓊脂稀釋法條件同樣也適用于微量肉湯稀釋法。
10.1.2 強化布氏肉湯
布氏肉湯的組成和制備，補充劑的制備和添加詳見附錄。
10.2 微量肉湯稀釋板準備
（1） 本法被稱為“微量稀釋”是因為使用了小體積的肉湯。這些小體積肉湯被分配到無菌塑料微量稀釋板。每個小孔至少應裝0.1mL肉湯。
（2） 為制備（10×）抗微生物藥溶液，應將濃縮的抗微生物藥貯存液按表4所述內容進行稀釋或進行倍比稀釋。將一份10×抗微生物藥溶液加入到九份肉湯中，得到所需最終濃度。
（3） 制備微量稀釋板的最簡便方法是使用分配裝置。它可以用至少10mL肉湯制成的抗微生物藥稀釋液按照每孔0.1（±0.02）mL的量分配到標準的96孔中。
（4） 加完各種抗微生物藥稀釋液的微量稀釋板應使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20℃（最好<-60℃）貯存。某些藥物如克拉維酸和亞胺培南，必須貯存在-60℃以下。應防止反復凍融。
10.3 微量肉湯稀釋板的接種
使微生物生長到濁度等于0.5號麥氏標準或將菌落直接制成懸液得到相同濁度，制備標準化的接種物。
（1） 調整好的接種菌懸液最好在15分鐘內用水或鹽水稀釋，接種后每管或每孔大約含1×106CFU/mL。為獲得此最終接種物而采取的稀釋步驟，可因接種物加到單個孔的加樣方法不同而不同，因此對于每一種情況都必須進行計算。計算時必須知道微量稀釋試驗要加到孔內的接種物的確切體積。例如，如果孔內培養基體積是0.1mL，接種物體積為0.01mL,那么應將0.5號麥氏懸液（約1.5×108CFU/mL）按1:15稀釋以獲得1×107CFU/mL的菌液。當取0.01mL此菌液接種肉湯時，細菌的最終測試濃度為1×106CFU/mL(或1×105CFU/孔)。
（2） 按上述方法對接種物進行標準化后15分鐘內，可以用接種裝置取體積不超過小孔體積10％的接種物（如在0.1mL抗微生物藥液中接種物應≤10µL）接種微量稀釋板的每個孔。相反，如果用0.05mL的吸管，每孔的內容物將被1:2稀釋。
（3） 為菌落計數，實驗室應經常用脆弱擬桿菌ATCC25285練習，以保證技術熟練。
10.4 微量肉湯稀釋板孵育
（1） 為保證孵育溫度，微量稀釋板的疊放不應超過四層。
（2） 接種好的微量稀釋板應放在厭氧環境中35℃孵育46-48小時。
（3） 應采取措施防止微量稀釋板的蒸發。
10.5 判讀微量肉湯稀釋終點
（1） 在黑色，使用間接光無反射光的背景下觀察，放大鏡可使用。
（2） 如果生長對照孔的生長微弱或不生長，則不應判讀。
（3） MIC終點應是觀察到的無細菌生長或最顯著抑制細菌生長的抗微生物藥濃度。一些藥物/病原菌組合可觀察到拖尾效應。
11. β-內酰胺酶試驗
在敏感試驗之前，可使用產色頭孢菌素為基礎的方法進行除脆弱擬桿菌菌群外厭氧菌β-內酰胺酶活性檢測。大多數脆弱擬桿菌菌群分離株產生β-內酰胺酶，認為對青霉素耐藥，因此不需要常規β-內酰胺酶檢測。
12. 質量控制的方法
12.1目的
質控工作的目的是監測敏感試驗步驟的精密度和準確度，試劑和設備的質量，和進行試驗的工作人員的操作。為達到上述目的，最好選用遺傳性穩定和在特定方法中有用的標準參考菌株。可向國家藥品及食品監督管理局檢定所菌種庫購買。
12.2 批次的質控
對于瓊脂稀釋，每一批新的培養基、試劑、補充劑或抗微生物藥首次使用時應進行所有三種質控菌株的質控試驗。對于自制的微量肉湯稀釋板，每一批至少取一個微量稀釋板孵育過夜以保證培養基的無菌性（剩余稀釋板可冷凍貯存于-20℃，最好是-60℃）。對于商業制備的平板，應依據廠商說明進行質控。
12.3質控菌株和質控頻率
有三種質控菌株常用于質控。厭氧菌敏感試驗時，瓊脂稀釋推薦使用以下至少兩種質控菌株來監測試驗步驟。微量肉湯稀釋和臨床分離株的常規試驗則推薦使用一種或一種以上質控菌株。應使用列于表5和表6中的限制對試驗系統的整體表現進行監控。
脆弱擬桿菌 ATCC 25285
多型擬桿菌 ATCC 29741
遲緩優桿菌 ATCC 43055
12.4 糾正措施
當質控超過特定范圍而且結果失控，應尋找原因（如使用了錯誤的質控菌株，菌株明顯的污染，或使用了錯誤的孵育條件或溫度等），并做出失控報告，重新操作直至在控，經科負責人批準再實施臨床檢測。
12.5 其他對照步驟
12.5.1 生長對照
每一種瓊脂稀釋平板和微量肉湯稀釋板都應包含一個不含抗微生物藥的基礎培養基做生長對照，以評價受試菌的活力。對于肉湯試驗，生長對照亦可作為判讀終點時的濁度對照。
12.5.2 純度對照
瓊脂或肉湯稀釋試驗接種時，從每一種接種物中取樣在強化布氏瓊脂平板上劃線，厭氧和需氧孵育過夜以檢測混合培養物，同時如果需要重復試驗，它可以提供新鮮的單個菌落。這一步驟對于肉湯稀釋法特別重要，因為在肉湯稀釋法中，混合培養物有可能未被察覺。
12.5.3 接種物對照
定期抽取代表性接種物進行平板計數以保證0.5號麥氏標準、標準化的接種步驟和接種物的稀釋在允許范圍內。用于平板計數的樣品應在接種后立即取自微量稀釋板的生長對照孔或者是多點接種器的一個隨機保存孔。
12.5.4 終點稀釋對照
定期對終點解釋進行監測可以減少不同觀察者之間對終點解釋的差異。所有進行本試驗的實驗室人員都應獨立判讀一套選定的稀釋試驗。將記錄的結果同某個有經驗判讀者的結果進行比較。所有判讀者相互之間的差異不能超過±1倍比濃度變化。
附錄:培養基和補充劑的制備
1 補充劑
1.1氯化血紅素貯存液（5mg/mL）
(1) 將0.1g氯化血紅素溶解于2mL1.0N的NaOH中。
(2) 加入蒸餾水至20mL,121℃滅菌15分鐘。
(3) 避光貯存于4-8℃不超過一個月。
1.2氫氧化鈉（1.0N）
(1) 將40g氫氧化鈉于溶解于1L的蒸餾水中。
(2) 室溫貯存于密封容器不超過六個月。
1.3 維生素K1溶液
1.3.1貯存液（10mg/mL）
(1) 將0.2mL維生素K1加到20mL 95%乙醇中。
(2) 4-8℃貯存于黑色瓶中不超過一年。
1.3.2 工作液（1mg/mL）
(1) 將1mL貯存液加到9mL的滅菌蒸餾水中。
(2) 4-8℃貯存于黑色瓶中不超過一個月。
1.4 碳酸氫鈉貯存液（20mg/mL）
(1) 將2g NaHCO3溶解于100mL的蒸餾水中。
(2) 濾過滅菌（孔徑0.2μm）。
(3) 使用當天制備。
1.5 脫纖維羊血
（1） -20℃或更低溫度冷凍脫纖維羊血。
（2） 融化羊血。可允許方法包括35-37℃水浴中快速融化或2-8℃緩慢融化過夜。
（3） 使用前翻轉容器數次充分混勻。
（4） 加入到融化布氏瓊脂前48-50℃水浴加熱。
1.6馬凍融血（LHB，50％）
（1） 無菌混勻等量脫纖維馬血和滅菌蒸餾水（50％）。
（2） 將50％馬血冷凍（≤-20℃）和融化五5-7次，直到細胞完全溶解。
（3） 12，000×g離心20分鐘
（4） 棄去表層物，檢查清晰度（不含影響判讀MIC終點的沉淀物）。用于微量肉湯稀釋試驗，肉湯和LHB必須清晰。必要時離心。
注意：用于微量肉湯稀釋法的馬凍融血有商業來源。
2 培養基
2.1強化布氏瓊脂
（1） 按下列配方配制布氏瓊脂粉末
胰消化酪蛋白 10g
動物組織多肽消化物10g
右旋糖1g
酵母提取物2g
氯化鈉5g
亞硫酸鈉0.1g
瓊脂15g
（2） 1,000mL蒸餾水中加入:
布氏瓊脂粉末43g
氯化血紅素貯存液1mL
維生素K1工作液1mL
（3） 煮沸溶解瓊脂。121℃高壓滅菌15分鐘。
（4） 培養基冷卻至48-50℃。
（5） 加入50mL滅菌脫纖維羊血。
注意：不加入脫纖維羊血的培養基可以在試管或瓶子小體積分裝冷凍。試驗時溶解培養基，冷卻至48-50℃。每100mL培養基加入5mL滅菌脫纖維羊血。
2.2強化布氏肉湯
（1） 按下列配方配制布氏肉湯粉末
胰消化酪蛋白 10g
動物組織多肽消化物10g
右旋糖1g
酵母提取物2g
氯化鈉5g
亞硫酸鈉0.1g
（2） 1,000mL蒸餾水中加入:
布氏肉湯粉末28g
氯化血紅素貯存液1mL
維生素K1工作液1mL
（3）煮沸溶解。121℃高壓滅菌15分鐘。
（4）肉湯冷卻至4℃，加入100mL滅菌馬凍融血（50％）。
（5）4-8℃貯存。
2.3 硫代硫酸鹽營養肉湯
（1） 1,000mL蒸餾水中加入
不含指示劑的硫代硫酸鹽培養基 30g
氯化血紅素貯存液1mL
維生素K1工作液1mL
（2） 煮沸溶解瓊脂（硫代硫酸鹽肉湯含有少量瓊脂）。每管5mL分裝至試管中。
（3） 121℃高壓滅菌15分鐘。
（4） 避光貯存于常溫不超過六個月。
（5） 使用時煮沸五分鐘；冷卻。每管加入0.25mL濾過滅菌的碳酸氫鈉貯存液。
（6） 做為加入碳酸氫鈉替代品，高壓滅菌前每管可加入大理石碎片。
2.4麥氏濁度標準（0.5號）
（1） 將0.5mL 0.048mol/L的BaCL2 (1.175%w/v BaCL2·2H2O)加到99.5mL 0.18mol/L（0.36N）的H2SO4(1%v/v)中并不斷攪動以維持混懸狀態。
（2） 按每管4-6mL將硫酸鋇懸液分裝于帶懸蓋的管子中，管子尺寸應與培養或稀釋接種菌所用的管子一致。
（3） 這些管子應密封并貯存于室溫避光處。
（4） 每次使用前，應將濁度標準管置于旋轉混勻器上劇烈振動，目測其外觀濁度應均勻一致。若有大顆粒出現，此標準管應更換。
（5） 使用前核實其正確濃度，每個月都應證實或更換。濁度標準的正確濃度應使用分光光度計測定吸光度核實。該分光光度計光徑為1cm，并配有合適的比色杯。0.5號麥氏標準管在625nm處的吸光度值應為0.08-0.10。
注意：商業上可得到乳膠顆粒懸液制成的麥氏分光光度計標準。使用時輕輕反轉混勻（而不是在旋轉混勻器上）。
表1:厭氧菌試驗應考慮的抗微生物藥推薦分組
|
|
脆弱擬桿菌菌群
|
除脆弱擬桿菌菌群外
革蘭氏陰性厭氧菌a
|
除產氣莢膜梭菌外梭菌屬菌種
|
產氣莢膜梭菌
消化球菌屬
無芽孢革蘭氏陽性菌
|
|
|
|
β-內酰胺酶b,c
陽性菌株
|
β-內酰胺酶b
陰性菌株
|
|
||||
|
首選
|
氨芐西林/舒巴坦或阿莫西林/克拉維酸
哌拉西林/三唑巴坦或替卡西林/克拉維酸（分離株對氨芐西林/舒巴坦和/或阿莫西林/克拉維酸耐藥時）
|
氨芐西林/舒巴坦或阿莫西林/克拉維酸
哌拉西林/三唑巴坦或替卡西林/克拉維酸（對氨芐西林/舒巴坦或阿莫西林/克拉維酸耐藥時）
|
氨芐西林或
青霉素c
|
青霉素或
氨芐西林c
|
氨芐西林或
青霉素c
|
|
|
阿莫西林/克拉維酸或氨芐西林/舒巴坦
哌拉西林/三唑巴坦或替卡西林/克拉維酸
|
||||||
|
克林霉素
|
克林霉素
|
|
||||
|
頭孢西丁
頭孢替坦
|
頭孢西丁或
頭孢替坦
|
甲硝唑
|
甲硝唑
|
|
||
|
克林霉素
|
克林霉素
|
頭孢西丁或
頭孢替坦
|
|
|||
|
亞胺培南或
美羅培南
|
亞胺培南或
美羅培南
|
克林霉素
|
|
|||
|
亞胺培南或美羅培南
|
|
|||||
|
甲硝唑
|
甲硝唑
|
甲硝唑
|
|
|||
|
次選
|
頭孢唑肟
頭孢曲松
|
頭孢唑肟
頭孢曲松
|
頭孢替坦或
頭孢西丁或
頭孢唑肟
頭孢曲松
|
頭孢唑肟
頭孢曲松
|
頭孢替坦或
頭孢唑肟或
頭孢西丁
頭孢曲松
|
|
|
氯霉素
|
氯霉素
|
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
|
|
|||
|
哌拉西林
|
四環素
|
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
|
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
|
|
||
|
曲發沙星
|
曲發沙星
|
|||||
|
曲發沙星
|
|
|||||
a. 包括擬桿菌屬其它菌種，普雷沃氏菌屬，卟啉單胞菌屬，梭桿菌屬，韋榮氏球菌屬，薩頓氏菌屬，嗜膽菌屬。
b. β-內酰胺酶（發色頭孢菌素）
c. 如果β-內酰胺酶陽性，報告青霉素和氨芐西林耐藥。
表2:解釋標準和相對應最低抑菌濃度（MIC）值（μg/mL）
|
抗微生物藥
|
敏感
|
中介
|
耐藥
|
|
阿莫西林/克拉維酸
|
≤4/2
|
8/4
|
16/8
|
|
氨芐西林
|
≤0.5
|
1
|
2
|
|
氨芐西林/舒巴坦
|
≤8/4
|
16/8
|
32/16
|
|
頭孢美唑
|
≤16
|
32
|
64
|
|
頭孢哌酮
|
≤16
|
32
|
64
|
|
頭孢噻肟
|
≤16
|
32
|
64
|
|
頭孢替坦
|
≤16
|
32
|
64
|
|
頭孢西丁
|
≤16
|
32
|
64
|
|
頭孢唑肟
|
≤32
|
64
|
128
|
|
頭孢曲松
|
≤16
|
32
|
64
|
|
氯霉素
|
≤8
|
16
|
32
|
|
克林霉素
|
≤2
|
4
|
8
|
|
亞胺培南
|
≤4
|
8
|
16
|
|
甲硝唑
|
≤8
|
16
|
32
|
|
美羅培南
|
≤4
|
8
|
16
|
|
美洛西林
|
≤32
|
64
|
128
|
|
青霉素
|
≤0.5
|
1
|
2
|
|
哌拉西林
|
≤32
|
64
|
128
|
|
哌拉西林/三唑巴坦
|
≤32/4
|
64/4
|
128/4
|
|
四環素
|
≤4
|
8
|
16
|
|
替卡西林
|
≤32
|
64
|
128
|
|
替卡西林/克拉維酸
|
≤32/2
|
64/2
|
128/2
|
|
曲發沙星
|
≤2
|
4
|
8
|
表3:制備抗微生物藥貯存液需要的溶劑和稀釋液b
|
抗微生物藥
|
溶劑
|
稀釋液
|
|
阿莫西林和替卡西林;
克拉維酸
|
磷酸緩沖液，pH6.0，0.1mol/L
|
磷酸緩沖液，pH6.0，0.1mol/L
|
|
氨芐西林
|
磷酸緩沖液，pH8.0，0.1mol/L
|
磷酸緩沖液，pH6.0，0.1mol/L
|
|
頭孢替坦
|
二甲基亞砜
|
水
|
|
氯霉素
|
95％乙醇
|
水
|
|
甲硝唑
|
二甲基亞砜
|
水
|
|
亞胺培南
|
磷酸緩沖液，pH7.2，0.01mol/L
|
磷酸緩沖液，pH7.2，0.01mol/L
|
注意：所有貯存液應置于-70℃或更低。融化后不應重新冷凍。通常不適于貯存在無霜冷凍柜中。
a. 這些溶劑和稀釋液用于制備抗微生物藥貯存液，這些藥物需要水以外的溶劑。它們可以用水或肉湯進一步稀釋。除腳注“b”外，可用水作溶劑或稀釋液的藥物包括：羧芐西林，頭孢孟多，頭孢美唑，頭孢哌酮，頭孢噻肟，頭孢西丁，頭孢唑肟，頭孢曲松，克林霉素，美洛西林，青霉素，哌拉西林，哌拉西林/三唑巴坦，四環素類，曲發沙星和萬古霉素。
b. 以上未列出的所有其它頭孢霉素類和頭霉素類用pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液（除非廠商有其它說明），用滅菌蒸餾水進一步稀釋。
表4:瓊脂稀釋法或微量肉湯稀釋法敏感試驗中抗微生物藥稀釋液的制備方案
|
抗微生物藥稀釋液
|
瓊脂或肉湯中
1:10稀釋的
最終濃度
（μg/mL）
|
Log2
|
|||||
|
步驟
|
濃度
(μg/mL)
|
來源
|
體積（mL）
|
＋蒸餾水(mL)
|
＝中間濃度(μg/mL)
|
||
|
1
|
5120
|
貯存液
|
2
|
2
|
2560
|
256
|
8
|
|
2
|
5120
|
貯存液
|
1
|
3
|
1280
|
128
|
7
|
|
3
|
5120
|
貯存液
|
1
|
7
|
640
|
64
|
6
|
|
4
|
640
|
步驟3
|
2
|
2
|
320
|
32
|
5
|
|
5
|
640
|
步驟3
|
1
|
3
|
160
|
16
|
4
|
|
6
|
640
|
步驟3
|
1
|
7
|
80
|
8
|
3
|
|
7
|
80
|
步驟6
|
2
|
2
|
40
|
4
|
2
|
|
8
|
80
|
步驟6
|
1
|
3
|
20
|
2
|
1
|
|
9
|
80
|
步驟6
|
1
|
7
|
10
|
1
|
0
|
|
10
|
10
|
步驟9
|
2
|
2
|
5
|
0.5
|
-1
|
|
11
|
10
|
步驟9
|
1
|
3
|
2.5
|
0.25
|
-2
|
|
12
|
10
|
步驟9
|
1
|
7
|
1.25
|
0.125
|
-3
|
表5:參比瓊脂稀釋試驗標準質控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質控允許范圍
|
抗微生物藥
|
脆弱擬桿菌
ATCC 25285
|
多型擬桿菌
ATCC 29741
|
遲緩優桿菌
ATCC 43055
|
|
阿莫西林/克拉維酸
|
0.25-1
|
0.5-2
|
Nra,b
|
|
氨芐西林
|
16-64
|
16-64
|
-b
|
|
氨芐西林/舒巴坦
|
0.5-2
|
0.5-2
|
0.25-2
|
|
頭孢美唑
|
8-32
|
32-128
|
4-16
|
|
頭孢哌酮
|
32-128
|
32-128
|
32-128
|
|
頭孢噻肟
|
8-32
|
16-64
|
64-256
|
|
頭孢替坦
|
4-16
|
32-128
|
32-128
|
|
頭孢西丁
|
4-16
|
8-32
|
4-16
|
|
頭孢唑肟
|
NRa
|
4-16
|
16-64
|
|
頭孢曲松
|
32-128
|
64-256
|
NRb
|
|
氯霉素
|
2-8
|
4-6
|
-b
|
|
克林沙星
|
0.03-0.12
|
0.06-0.5
|
0.03-0.12
|
|
克林霉素
|
0.5-2
|
2-8
|
0.06-0.25
|
|
ertapenem
|
0.06-0.25
|
0.25-1
|
0.5-2
|
|
亞胺培南
|
0.03-0.12
|
0.125-0.5
|
0.125-0.5
|
|
美洛培南
|
0.06-0.25
|
0.125-0.5
|
0.125-0.5
|
|
甲硝唑
|
0.25-1
|
0.5-2
|
-b
|
|
美洛西林
|
16-64
|
8-32
|
8-32
|
|
青霉素
|
8-32（16-64）c
|
8-32（16-64）c
|
-b
|
|
哌拉西林
|
2-8
|
8-32
|
8-32
|
|
哌拉西林/三唑巴坦
|
0.12/4-0.4/4
|
4/4-16/4
|
4/4-16/4
|
|
四環素
|
0.12-0.5
|
8-32
|
-b
|
|
替卡西林
|
16-64
|
16-64
|
16-64
|
|
替卡西林/克拉維酸
|
NRa
|
0.5/2-2/2
|
16/2-64/2
|
|
曲發沙星
|
0.12-0.5
|
0.25-1
|
0.25-1
|
注意：除青霉素外，數值的單位是μg/mL。
a. NR表示此病原菌/抗微生物藥組合無推薦MIC范圍。某些情況下，嘗試確定質控范圍顯示得到的數值范圍廣(阿莫西林/克拉維酸和遲緩優桿菌；頭孢曲松和遲緩優桿菌；頭孢唑肟和脆弱擬桿菌；替卡西林/克拉維酸和脆弱擬桿菌)。相應地，這些沒有適合的質控。
b. “NR”表明盡管廣泛研究，尚未成功建立質控范圍；連字符表示沒有做過研究。
c. 青霉素數值的單位是unit/mL。
表6:微量肉湯稀釋試驗質控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質控允許范圍
|
抗微生物藥
|
脆弱擬桿菌ATCC25285
|
多型擬桿菌ATCC29741
|
遲緩優桿菌ATCC43055
|
|
氨芐西林/舒巴坦（2:1）
|
0.5/0.25-2/1
|
0.5/0.25-2/1
|
0.5/0.25-2/1
|
|
頭孢替坦
|
1-8
|
16-128
|
16-64
|
|
頭孢西丁
|
2-8
|
8-64
|
2-16
|
|
頭孢唑肟
|
NR
|
NR
|
8-32
|
|
克林霉素
|
0.5-2
|
2-8
|
0.06-0.25
|
|
ertapenem
|
0.06-0.5
|
0.5-2
|
0.5-4
|
|
亞胺培南
|
0.03-0.25
|
0.25-1
|
0.25-2
|
|
甲硝唑
|
0.25-2
|
0.5-4
|
0.125-0.5
|
|
哌拉西林
|
4-16
|
8-64
|
8-32
|
|
哌拉西林/三唑巴坦
|
0.03-0.25
|
2/4-16/4
|
8/4-32/4
|
|
替卡西林/克拉維酸
|
0.06-0.5
|
0.5/2-2/2
|
8/2-32/2
|
|
曲發沙星
|
0.125-0.5
|
0.5-2
|
0.25-2
|
注意：對于四倍稀釋范圍，允許范圍邊緣的結果應懷疑。從其它質控菌株的數據來證實質控效力。
《厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗方法》編制說明
一．工作簡要過程
（一） 工作的提出
2001年衛生部標委會檢驗分會提出制定該標準。
（二） 主要工作進程
由北京大學人民醫院檢驗科張正及岳志紅在衛生部頒發的《全國臨床檢驗操作規程》（第三版）的基礎上，根據美國國家臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS）M11-A5文件－厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗方法（已批準的標準－第五版）[ISBN 1-56238-429-5]，結合中國國情及衛生系統的實際情況和要求修改成文。
二．征詢意見經過
成稿后曾向許淑珍，馬紀平，胡繼紅，沈定霞，周貴民等5位專家征詢意見（見附頁）。
三．定稿
根據專家意見，修訂該文件為現文本。
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